1.一种质粒DNA分子标准物质的量值修正方法，其特征在于，通过微滴数字PCR选择校准质粒DNA分子量值偏倚的填充物来修正质粒DNA量值。

2.一种质粒DNA分子填充物的选择方法，其特征在于，按照如下步骤进行：（1）选取与质粒DNA分子标准物质量值不相关的物种作为填充物，至少选择5种；（2）分离纯化填充物DNA；

（3）将填充物加入质粒DNA分子中，充分混匀，置于4℃条件下保存；

（4）采用微滴数字PCR方法，分别对质粒DNA分子、质粒DNA分子和不同填充物的组合进行测试；

（5）结果的收集与统计：在结果中筛选出符合质粒DNA分子标准物质理论值的组合，确定以此填充物作为标准物质量值修正的最佳填充物。

权 利 要 求 书

一种质粒DNA分子标准物质的量值修正方法

技术领域

[0001]本发明属于生物基因技术领域，具体涉及一种质粒DNA分子标准物质的量值修正方法。

背景技术

[0002]质粒DNA标准物质由一种含有外源基因片段和内标准基因片段的质粒DNA制备而成。相比其他种类标准物质，质粒DNA具有易于富集，非农产品来源，高效、制备快捷等优点，同时也解决了材料获取困难的问题，已广泛应用于医疗诊断、环境微生物监测、转基因成分检测及分子生物学基础研究中。

[0003]而目前仅有四种质粒DNA标准物质研制与生产，分别用于检测：转基因玉米98140(ERM-AD427)、转基因大豆356043(ERM-AD425)、转基因玉米NK603(ERM-AD415)、MON810(ERM-AD413)质粒DNA标准物质。重要的是这四种质粒DNA采用测序比值作为定值结果，未真正的实现量值确定与量值溯源。因此，转基因质粒DNA标准物质的研制和应用成为国内外农业转基因生物安全管理体系建设的当务之急，也将成为转基因检测、监测的重要技术支撑之一。

[0004]质粒DNA分子标准物质研制的瓶颈之一就是理论值与测量值之间的偏倚问题。理论值即为通过基因克隆操作，定向插入质粒载体中已知数目的片段，并通过测序技术，验证了插入片段的位置、大小及数量。而测量值，是指通过核酸定量技术，确定质粒DNA分子中插入的数量及数量间的比值。举例如下：某质粒中，插入了玉米内源基因1个，转基因玉米特异性检测基因1个，通过测序，证明了上述操作，在应用时，转基因玉米特异性基因与内源基因的比值为1:1，可表示为1.0或100％，即可用作转基因玉米的含量测试。而通过实时荧光定量PCR或数字PCR平台测量时，往往得到的结果不是1:1的。

发明内容

[0005]本专利发明了一种质粒DNA分子标准物质的量值修正方法，解决了质粒DNA分子量值偏倚问题。

[0006]一种质粒DNA分子标准物质的量值修正方法，通过微滴数字PCR技术选择校准质粒DNA分子量值偏倚的填充物来修正质粒DNA量值。

[0007]本发明所涉及的量值修正是通过微滴数字PCR技术选择最佳的质粒DNA分子标准物质填充物，保证测试结果能与理论值吻合，具体依赖如下的步骤：

[0008](1)为避免填充物DNA对目标物种量值的干扰，需选取与质粒DNA分子标准物质量值不相关的物种作为填充物，至少选择5种；

[0009](2)采用经济、高效、稳定和试用性强的核酸提取与纯化方法，分离纯化填充物DNA；[0010](3)将填充物加入质粒DNA分子中，充分混匀，置于4℃条件下保存。