1.一种高准确度糖化血红蛋白标准物质定值技术，其特征在于，包括以下步骤：(1)合成用于血红蛋白和糖化血红蛋白定量的特性肽段；(2)特征肽段纯度的测定；(3)糖化血红蛋白的酶解；(4)样品酶解液的毛细管电泳-同位素稀释质谱分析；(5)酶解液中特异性肽段含量的计算；(6)糖化血红蛋白含量的计算。

2.根据权利要求1所述的高准确度糖化血红蛋白标准物质定值技术，其特征在于：所述步骤(1)具体为，通过化学合成的方式获得用于血红蛋白定量的特异性肽段VHLTPE及其对应的同位素标记肽段VH*LTPE；通过化学合成的方式获得用于糖化血红蛋白定量的特异性肽段Glc-VHLTPE及其对应的同位素标记肽段Glc-VH*LTPE。

3.根据权利要求2所述的高准确度糖化血红蛋白标准物质定值技术，其特征在于：所述步骤(2)具体为，将合成的肽段水解成氨基酸，定量添加同位素标记氨基酸，以国家氨基酸标准物质为标准建立高效液相色谱-同位素稀释质谱方法测定水解液中稳定氨基酸含量，并据此计算特征肽段纯度；对于特异性肽段VHLTPE，用于定量的氨基酸为缬氨酸V、亮氨酸L和脯氨酸P；对于特异性肽段Glc-VHLTPE，用于定量的氨基酸为亮氨酸L和脯氨酸P。

4.根据权利要求3所述的高准确度糖化血红蛋白标准物质定值技术，其特征在于：所述步骤(3)具体为，取适量糖化血红蛋白溶解于pH＝4.0的醋酸铵缓冲液中，依据加入标准物质侯选物的量按照血红蛋白量:Glu-C量＝100:1的比例加入适量Glu-C，在60℃下孵育24小时进行酶切。

5.根据权利要求4所述的高准确度糖化血红蛋白标准物质定值技术，其特征在于：所述步骤(4)具体为，在酶解后的酶解液中加入同位素标记的VH*LTPE和Glc-VH*LTPE，混合均匀后用0.22μm滤膜过滤进行毛细管电泳-同位素稀释质谱分析；使用的分离毛细管为57cm×75μm聚酰亚胺涂层石英毛细管，紫外检测器，检测波长200nm，50mM pH＝5.0的醋酸铵缓冲液作为分离介质；压力进样，分离电压为20kV，质谱检测采用选择性检测以下离子峰：m/z＝695(VHLTPE)，m/z＝702(D7-VHL*TPE)，m/z＝857(G-VHLTPE)，m/z＝864(D7-G-VHLTPE)，m/z＝623(VHLTPG)；同时采用合成的VHLTPE、VH*LTPE、Glc-VHGLTPE及Glc-VH*LTPE配制低标和高标，采用括号法对酶解液中的VHLTPE和Glc-VHLTPE进行准确测定。

6.根据权利要求5所述的高准确度糖化血红蛋白标准物质定值技术，其特征在于：所述步骤(5)具体为，根据下述公式，计算酶解液中VHLTPE和Glc-VHLTPE的含量，式中：c—为样品中VHLTPE(Glc-VHLTPE)的含量，mg/g；Ms——为样品溶液中VH*LTPE(Glc-VH*LTPE)的质量，mg；Rs——为样品溶液中VHLTPE(Glc-VHLTPE)与VH*LTPE(Glc-VH*LTPE)的峰面积比；I1——为高标溶液VHLTPE(Glc-VHLTPE)与VH*LTPE(Glc-VH*LTPE)的质量比；I2——为低标溶液VHLTPE(Glc-VHLTPE)与VH*LTPE(Glc-VH*LTPE)的质量比；R1——为高标溶液VHLTPE(Glc-VHLTPE)与VH*LTPE(Glc-VH*LTPE)的峰面积比；为低标溶液VHLTPE(Glc-VHLTPE)与VH*LTPE(Glc-VH*LTPE)的峰面积比；M—为样品质量，g；P—为VHLTPE(Glc-VHLTPE)的纯度。

7.根据权利要求6所述的高准确度糖化血红蛋白标准物质定值技术，其特征在于：所述步骤(6)具体为，根据下面的的公式，计算样品中糖化血红蛋白的含量，式中，mGlc-VE6——酶解液中Glc-VHLTPE的含量，g/g；MWGlc-VE6——Glc-VHLTPE的分子量；mVE6——酶解液中VHLTPE的含量，g/g；MWVE6——VHLTPE的分子量。

一种高准确度糖化血红蛋白标准物质定值技术

技术领域

[0001]本发明涉及物质含量测定技术领域，特别是涉及一种糖化血红蛋白标准物质定值技术。

背景技术

[0002]计量是实现单位统一、量值准确可靠的活动，研究建立高准确度的测量方法是计量学研究的重要内容之一。含量(浓度)描述了单位质量或体积中被测对象的数量，是化学与生物计量中的基本量值，为了实现含量(浓度)的准确测定，化学与生物计量中广泛采用同位素稀释质谱的方法作为计量方法。同位素稀释质谱方法是一种特殊的内标法，它以被测对象的稳定同位素标记物作为内标添加到样品中，由于同位素内标与待测化合物的物理和化学性质接近，因此在充分混匀以后同位素内标可以实时校正整个分析过程中的系统误差与随机误差，实现高准确度的测量。当添加同位素内标以后，由于同位素标记物与待测目标化合物理化性质接近，因此在前处理过程中两者的反应效率、损失率等都是一致的；在高效液相色谱分离过程中，同位素内标与待测目标化合物始终在一起，任意时刻施加到待测目标化合物上的扰动也同等程度的施加到同位素内标上，因此校正了分离过程中的随机误差与系统误差；在离子化的过程中，待测目标化合物与同位素标记物具有相同的离子化效率，两者被同等效率的离子化并进入到质谱仪中进行检测，最后在质谱的不同质荷比通道被检测。最后根据待测目标化合物和同位素标记物的比例及称量的质量进行计算。由于添加同位素内标后整个分析过程中各种影响因素均无法改变两者的比例，因此可以消除掉整个分析过程中的系统误差与随机误差，得到高准确度的定量结果。这使得同位素稀释质谱法也成为化学与生物计量中常用的计量基准方法之一。

[0003]对于生物样品的分析，通常采用高效液相色谱-同位素稀释质谱的方式进行样品中化学成分量的准确测定。高效液相色谱作为常用的分离手段，能够较好的用于有机分子、肽段、蛋白质、寡聚核酸、核酸等分子的分离。通过高效液相色谱-同位素稀释质谱联用的方式，已经成功解决了无机、有机小分子，以及核酸和蛋白质等生物大分子的准确定量，通过同位素内标的使用，克服了样品前处理、分离、离子化、质谱检测过程中的系统误差，从而达到很高的测量准确度，成为化学和生物计量的基准方法之一。虽然高效液相色谱-同位素稀释质谱已经取得了很大的成功，但是受到高效液相色谱在核酸、蛋白等生物大分子分离效能中的限制，高效液相色谱-同位素稀释质谱在核酸、蛋白等生物大分子准确定量中的应用还十分有限。毛细管电泳技术是近几十年发展起来新型分离分析技术，具有分离效率高、简单、经济、快速和微量、自动化程度高等优点。毛细管电泳采用电渗流来驱动化合物的分离，克服了高效液相色谱中采用压力驱动导致的各层流速不均匀导致的峰展宽，从而达到极高的理论塔板数，展示出远远优于高效液相色谱的柱效与分离能力。分离能力的提高有助于干扰组分的去除，结合同位素稀释质谱卓越的系统误差克服能力，使得毛细管电泳-同位素稀释质谱成为更为准确的定量方法。