甘肃省是蔬菜大省，主要以高原露地夏菜为主，6—9月份上市，由于海拔高、气候冷凉、光照充足等特点，蔬菜色泽好、营养丰富，具有明显的品质优势，主要销往沿海以及东南亚等80多个大中城市，很好地填补了我国东部及南方蔬菜“伏缺”季节的市场供应，形成了富有地域特色的“高原夏菜”品牌，是全国重要的高原夏菜和西菜东调基地。夏菠菜是甘肃高原夏菜的主要蔬菜品种，其富含类胡萝卜素、VC，色泽好、营养丰富，具有明显的品质优势。而高原夏菜采收期正值高温炎热季节，较春秋蔬菜采后更易黄化和腐烂，积累亚硝酸盐，尤其贮藏条件不当时，甚至会引起数倍或数百倍的累积。因而菠菜的采后保鲜是生产实践中亟需解决的难题。冰水混合物（0℃）处理作为一种蔬菜的物理保鲜手段，是将新鲜的蔬菜放入冰水体积比例为1∶1的混合物中浸泡，使蔬菜的温度瞬间达到0℃，降温速率快，使蔬菜的呼吸作用很快降到最低，是一种安全、绿色的保鲜手段。

臭氧作为一种强氧化剂，具有良好的杀菌防腐作用且无残留，在食品行业得到广泛的应用。Feliziani等对冷藏（2℃）期间的鲜食葡萄采用低质量浓度（0.075～0.500mg/L）持续的臭氧处理，结果表明，低质量浓度持续的臭氧处理可以抑制受感染果对健康果粒的侵染；李珍等选用间歇式臭氧处理冰温条件下贮藏的红提葡萄，结果表明，随着贮藏时间的延长，臭氧处理降低了红提葡萄的腐烂率、落粒率，能有效保持好果率，延缓葡萄果实的衰老和品质劣变，减缓由质量损失引起的新鲜度下降。王瑾等研究发现采用高浓度臭氧水保鲜鲜切花椰菜利大于弊，所以在鲜切花椰菜的加工工艺中宜采用高浓度臭氧水短时间的处理方案。Selma等用不同浓度的臭氧水处理鲜切莴笋，结果表明，5.4μL/L的臭氧水杀菌效果最好。溶菌酶是一种能水解细胞壁肽聚糖的比较稳定的碱性蛋白酶，主要通过切断细胞壁肽聚糖中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之间的β-1,4-糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂，细菌裂解。

已有报道称，T4溶菌酶因具有两亲性质的C端，可以直接干扰细菌、真菌和植物细胞的膜活性，进而抑制微生物生长，并非通过溶解细胞壁发挥抑菌活性。溶菌酶作为抗微生物药物具有良好的生物相容性，至今未出现耐药现象。已有许多将溶菌酶应用于水产品防腐保鲜中的研究，Hikima等通过对日本对虾的C型溶菌酶的研究证实，该溶菌酶对多种弧菌及鱼类的病原菌具有不同程度的杀菌作用。

De-la-re-vega等利用溶菌酶保鲜液对南美白对虾进行研究，实验表明，溶菌酶保鲜液抑制弧菌属生长的效果与抑制滕黄微球菌的效果相当。也有研究将溶菌酶与保鲜剂以及保鲜技术相结合，Özogul等利用真空包装和气调包装（modifiedatmospherepackaging，MAP）对沙丁鱼进行包装，得出MAP比真空包装沙丁鱼的货架期延长3d，并且MAP中的细菌繁殖要缓慢得多，进一步证实了MAP技术的价值。Fernández等将溶菌酶与气调包装结合，使大西洋鲑鱼片的货架期延长。溶菌酶在果蔬的保鲜中也有一定的应用。张迪等研究1-甲基环丙烯（1-methylcyclopropene，1-MCP）结合溶菌酶处理对苹果保鲜效果的影响，结果表明，1.5μL/L1-MCP和质量分数0.08%溶菌酶处理能有效提高苹果的商品品质。周林宗等利用溶菌酶、海藻酸钠和壳聚糖复配保鲜液对油桃进行保鲜处理，结果发现含质量分数1%的壳聚糖、0.07%的溶菌酶和1%的海藻酸钠的复配保鲜液对油桃保鲜效果最好，能有效延缓质量损失率的上升及可溶性糖、VＣ含量的下降，降低了果实腐烂指数及呼吸强度。范林林研究了热处理、柠檬酸、溶菌酶、D-异抗坏血酸钠、壳聚糖等处理对鲜切寒富苹果的保鲜防腐效果，结果表明，溶菌酶处理能有效维持鲜切苹果的外观品质，抑制相对电导率、丙二醛含量、多酚氧化酶活性及菌落总数的增加，显著维持了过氧化物酶（peroxidase，POD）活性，质量分数0.08%溶菌酶保鲜效果最佳。

溶菌酶在蔬菜防腐保鲜中的应用研究鲜见报道，本实验通过溶菌酶结合冰水混合物处理、臭氧水处理及溶菌酶处理3种方法对新鲜菠菜进行处理，研究不同处理方法对菠菜贮藏期品质及硝酸盐含量的影响，以选出适合菠菜保鲜的方法，为减少化学保鲜剂的应用，开发简便、安全的菠菜贮藏保鲜技术提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料与试剂

实验所用新鲜的夏菠菜采自高原夏菜主产区兰州市永登县龙泉镇，挑选长势均匀一致的菠菜，早上7点取样，样品取好后装入泡沫箱内及时拉回放入冷库进行处理。溶菌酶上海源叶生物科技有限公司；α-淀粉酶、蛋白酶、大鼠血清诺维信（中国）生物技术有限公司；甲醇（色谱级）、磷酸二氢钾、β-巯基乙醇、抗坏血酸美国赛默飞世尔科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2仪器与设备

WSC-S色差计上海精密仪器仪表有限公司；SQP型电子天平赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；Cary-100型紫外-可见分光光度计、1200高效液相色谱仪美国安捷伦科技有限公司；TGL-16M台式离心机湘南星科科学仪器有限公司；HH-S6型电热恒温水浴锅北京科伟永兴仪器有限公司；HY-019-200A臭氧发生器广州佳环电器科技有限公司。

1.3方法

1.3.1菠菜处理

本次实验所用的臭氧发生器开机0.5h后，臭氧水中臭氧质量浓度稳定在3mg/L左右，用臭氧水与水按比例混合得到2.3mg/L的臭氧水。将挑选的菠菜放置在白色小塑料筐中，每筐500g左右。按以下分组进行相应处理：第1组，常温蒸馏水处理，作为CK组；第2组，质量浓度为1g/L溶菌酶处理；第3组，2.3mg/L的臭氧水处理（根据本课题前期臭氧水在叶菜类最佳保鲜质量浓度确定）；第4组，将1g的溶菌酶溶解到冰水体积比为1∶1的总体积为1000mL的冰水中，配成溶菌酶质量浓度为1g/L的冰水混合物，作为冰水＋溶菌酶处理组。将菠菜分别放入以上4组处理液中浸泡10min，自然风干后，装入27cm×19cm×20cm聚丙烯密闭箱内，放入4℃的生化培养箱，设3组平行，每2d取样，所取样品放入－26℃内保存，进行各指标的测定。

1.3.2色泽的测定

将处理好的贮藏期的菠菜，每个处理选取3株，标记同一块叶片，用于菠菜色亮度L*值、红绿度a*值和黄蓝度b*值的测量，分别按照公式（1）、（2）计算色差∆E和色调角H值。ΔE˙ΔL*2ˇΔa*2＋Δb*2（1）H˙arctanb*a*（2）式中：ΔL*、Δa*、Δb*分别表示样品测定值与鲜样差值；H值变化范围在0°～180°之间，颜色变化依次为紫红、红、橙红、橙、黄、黄绿、绿和蓝绿，当H＝0°时为紫红色；H＝90°时为黄色；H＝180°时为绿色；H＞100°时，H值越大，果实绿色越深；H＜50°时，H值越小，果实红色越深。

1.3.3叶绿素、VC含量的测定

参照NY/T3082—2017《水果、蔬菜及其制品中叶绿素含量的测定分光光度法》，使用分光光度法测定叶绿素的含量。VC含量采用2,6-二氯靛酚滴定法测定。

1.3.4可溶性糖质量分数、可溶性蛋白含量的测定

可溶性糖质量分数采用蒽酮比色法[20]；可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝法。

1.3.5叶酸含量的测定

菠菜中叶酸的提取参考孟繁磊等[22]的三酶法。称取粉碎后菠菜样品0.2g于2mL离心管中，加入750μL磷酸盐缓冲溶液（含质量分数1%抗坏血酸钠盐和0.1%β-巯基乙醇），95℃水浴孵育15min后于冰上冷却，之后加入5mm钢珠，在组织研磨机中14000r/min研磨样品5min。匀浆液中加入750μL上述磷酸盐缓冲溶液和适量α-淀粉酶，静置10min，加入适量蛋白酶，37℃培养1h；100℃煮沸10min；冰上冷却后在4℃、14000r/min离心10min；吸取上清液，在上清液中加入适量大鼠血清，混匀后，于37℃培养2h；100℃煮沸灭活10min，冰上冷却1h后4℃、4000r/min离心15min，所得上清液即为叶酸提取液；吸取上清液分装于灭菌管中直接测定或冻存于－80℃。样品提取过程均需在避光下操作。叶酸含量测定采用高效液相色谱法，色谱条件：流动相为0.01mol/LKH2PO4-CH3OH溶液（体积比为89∶11，pH6.3）；柱温25℃；流速为1.0mL/min；进样量为20μL；紫外检测波长280nm；C18色谱柱（4.6nm×150nm，5μm）。

1.3.6草酸含量的测定

草酸含量测定参照曾芳等的分光光度法。取0.5g样品，在液氮中迅速研磨至粉末状，加入0.5mL蒸馏水转移至10mL离心管，70℃水浴加热30min，并摇动数次。取出后冷却过滤，取滤液2mL，分别加入2mL0.5mg/mLFeCl3溶液、20mL0.2mol/LpH2的KCl缓冲液、1.2mL质量分数0.5%的磺基水杨酸，并用蒸馏水将体系定容至25mL。显色30min后，以蒸馏水为参比，在510nm波长处测定吸光度，并计算样品中的草酸含量。

1.3.7硝酸盐、亚硝酸盐含量和硝酸还原酶、POD活力的测定硝酸盐含量的测定

参考GB5009.33—2016《食品国家安全标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中的紫外分光光度法；亚硝酸盐含量采用盐酸萘乙二胺法测定。硝酸还原酶活力的测定：取4份1g菠菜样品剪碎混匀，剪成1cm左右小段，放于塑料离心管中。其中1份做对照，另外3份做酶活力测定。在对照管预先加入1mL、质量分数30%三氯乙酸，然后在各管中都加入9mL0.1mol/LKNO3溶液。混匀后立即放入真空干燥培养箱内，抽真空1min，再通气，反复3次以上以便排出组织间隙的气体，使底物进入组织。最后通入氮气密封后，并在25℃黑暗中反应0.5h，再分别向测定管加入1mL、质量分数30%三氯乙酸，以终止酶反应。吸取2mL反应液，加入1mL、质量分数1%磺胺和1mL、质量分数1%的a-萘胺显色15min后，4000r/min离心5min，取上清液于540nm波长处测定其吸光度。硝酸还原酶活力以每克鲜质量样品每小时产生NO2－的质量计，单位为μg/（g·h）。POD活力参考ZhangYongfu等的方法。