任务目标

知识目标 1.了解金黄色葡萄球菌的相关知识。 2.掌握金黄色葡萄球菌检验的操作流程及结果报告。

技能目标 1.掌握金黄色葡萄球菌检验的操作步骤及要点。 2.学会辨别是否检出金黄色葡萄球菌。

素质目标 1.良好的实验操作习惯。 2.遵守实验室规章制度，严格按设备要求进行操作。

概述 革兰氏阳性球菌，排列为葡萄状，无芽孢、无荚膜。

金黄色葡萄球菌的流行病学一般有如下特点：季节分布，多见于春夏季；中毒食品种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品。此外，剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等引起的中毒事件也有报道。上呼吸道感染患者鼻腔带菌率83%，所以人畜化脓性感染部位常成为污染源。

致病性

金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶：         a.溶血毒素：外毒素，分α、β、γ、δ四种，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死；         b.杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞；         c.血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关；

d.脱氧核糖核酸酶：金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸酶能耐受高温，可用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌；         e.肠毒素：金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素，分为A、B、C、D、E及F五种血清型。肠毒素可耐受100℃煮沸30min而不被破坏，百万分之一克的这种肠毒素就能引起金黄色葡萄球菌中毒。它引起的食物中毒症状是呕吐和腹泻。         此外，金黄色葡萄球菌还产生溶表皮素、明胶酶、蛋白酶、脂肪酶、肽酶等。

设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料 设备和材料如下; (1)恒温培养箱:36℃士1C。 (2)冰箱:2℃~5℃。 (3)恒温水浴箱:37℃~65℃。 (4)天平:感量0.1g。 (5)无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。 (6)无菌锥形瓶:容量100mL、500mL (7)无菌培养皿;直径90mm。 (8)pH 计或pH 比色管或精密H试纸。

（1）7.5%氯化钠肉汤 （2）B-P琼脂平板 （3）脑心浸出液肉汤(BHI) （4）磷酸盐缓冲液 （5）革兰氏染色液 （6）无菌生理盐水

1、样品处理

固体样品：称取25 g 样品至盛有225 mL7.5%氯化钠肉汤的无菌均质杯内,8 000r/min~10 000r/min 均质1 min~2 min, 或放入盛有225 mL 7.5% 氯化钠肉汤无菌均质袋中, 用拍击式均质器拍打 1 min~2 min。 

液体样品：吸取25 mL 样品至盛有225 mL7.5%氯化钠肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠) 中, 振荡混匀。

 2、 增菌

将上述样品匀液于36℃±1℃培养18h～24h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长。

3、分离培养

将增菌后的培养物，分别划线接种到Baird-Parker平板和血平板，血平板36℃±1℃培养18～24h。Baird-Parker平板36℃±1℃培养18～24h。

 4、生化鉴定  菌落特征观察-涂片染色-血浆凝固酶试验

4.1  初步鉴定  BP平板菌落特征观察

金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上：圆形、光滑凸起、湿润、直径为2mm-3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。当用接种针触及菌落时具有黄油样黏稠感。 有时可见到不分解脂肪的菌株, 除没有不透明圈和清晰带外, 其他外观基本相同。 从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落, 其黑色常较典型菌落浅些,且外观可能较粗糙, 质地较干燥。

血平板菌落特征观察

金黄色葡萄球菌在血平板上：菌落呈金黄色，有时也为白色，大而突起、圆形、不透明、表面光滑，周围有可见完全透明溶血圈。

涂片染色 革兰氏染色镜检结果

金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，直径约为0. 5 μ m~1 μ m 。

4.2  确认鉴定    血浆凝固酶试验

 挑取 Baird-Parker 平板或血平板上至少 5 个可疑菌落(小于 5 个全选)，分别接种到 5mLBHI 和营养琼脂小斜面, 36℃±1℃ 培养 18h~24h 。

取新鲜配制兔血浆0.5 mL, 放入小试管中, 再加入 BHI 培养物0.2 mL~0.3 mL, 振荡摇匀, 置36 ℃ ±1 ℃ 温箱或水浴箱内, 每半小时观察一次, 观察6 h。

血浆凝固酶试验结果

如呈现凝固( 即将试管倾斜或倒置时, 呈现凝块) 或凝固体积大于原体积的一半, 被判定为阳性结果。 同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。 也可用商品化的试剂, 按说明书操作, 进行血浆凝固酶试验。          结果如可疑, 挑取营养琼脂小斜面的菌落到5 mL BHI,36 ℃ ±1 ℃ 培养18 h~48 h, 重复试验。