食品中沙门氏菌的测定

知识目标 1.了解沙门氏菌的来源、危害及处理措施。 2.掌握沙门氏菌检验的操作流程。

技能目标 1.掌握沙门氏菌检验的操作步骤。 2.掌握沙门氏菌检验生化试验操作流程及血清学试验操作。

素质目标 1.良好的实验操作习惯。 2.遵守实验室规章制度，严格按设备要求进行操作。

一、沙门氏菌的定义

沙门氏菌是一类革兰氏阴性、两端钝圆的短杆菌，无荚膜和芽孢，（除鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌外）都具有周身鞭毛，能运动，大多数具有菌毛，能吸附于宿主细胞表面或凝集豚鼠红细胞。

沙门氏菌属有的专对人类致病，有的只对动物致病，也有对人和动物都致病。沙门氏菌病是指由各种类型沙门氏菌所引起的对人类、家畜以及野生禽兽不同形式的总称。感染沙门氏菌的人或带菌者的粪便污染食品，可使人发生食物中毒。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。我国内陆地区也以沙门氏菌为首位。

与人体疾病有关的主要有副伤寒甲杆菌，副伤寒乙杆菌和鼠伤寒杆菌，副伤寒丙杆菌和猪霍乱杆菌，伤寒杆菌和肠炎杆菌等。除伤寒杆菌、副伤寒甲杆菌和副伤寒乙杆菌引起人类的疾病外，大多数仅能目引起家畜、鼠类和禽类等动物的疾病，但有时也可污染人类的食物而引起食物中毒。         沙门氏菌在水中不易繁殖，但可生存2-3周，冰箱中可生存3-4个月，在自然环境的粪便中可存活1-2个月。沙门氏菌最适繁殖温度为37℃，在20℃以上即能大量繁殖，因此，低温储存食品是一项重要预防措施。

二、试剂与仪器

1、所用器具           三角烧瓶、玻璃珠、具塞试管、培养皿、100 μL枪头、5mL枪头、称量勺、接种环、接种针

2、 仪器         分析天平、恒温培养箱、微型振荡器、超净工作台、高压灭菌锅

3、所用试剂和培养基          缓冲蛋白陈水(BPW)培养基          四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液

三、检验程序(详见PPT）

1、预增菌  (第一天)

无菌操作称取25g（mL）样品，置于盛有225mL 缓冲蛋白胨水 （BPW） 的无菌均质杯或合适容器内，以8000 r/min～10000 r/min均质1min～2min，或置于盛有225mL BPW  的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min 。若样品为液态，不需要均质，振荡混匀。如需调整pH，用1mol/L 无菌NaOH 或HCl 调pH 至6.8±0.2。无菌操作将样品转至500mL 锥形瓶或其他合适容器内（如均质杯本身具有无孔盖，可不转移样品），如使用均质袋，可直接进行培养，于36℃±１℃培养８ｈ～18ｈ。        如为冷冻产品，应在45℃以下不超过15min，或２℃～５℃不超过18ｈ解冻 。

2、预增菌  (第二天)

轻轻摇动培养过的样品混合物，移取１ｍＬ，转种于10mL TTB内，于42℃±１℃培养18ｈ～24ｈ。同时，另取１ｍＬ，转种于10mL BS内，于36℃±１℃培养18ｈ～24ｈ。

3、分离（第三天）

分别用直径３ｍｍ的接种环取增菌液１环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板（或 HE琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板），于36℃±１℃分别培养40ｈ～48ｈ（BS琼脂平板）或18h～24h（XLD琼脂平板、HE琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板），观察各个平板上生长的菌落 。

亚硫酸铋（BS）琼脂 （第四天）

菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变。

HE 琼脂（第四天）

蓝绿色或蓝色，多数菌株产硫化氢，菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色。

木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂 （第四天）

菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落。

DHL 琼脂（第四天）

无色半透明：产硫化氢菌落中心带黑色或几乎全黑色。 亚丽桑那菌株乳糖阳性菌株粉色。

SS 琼脂（第四天）

无色半透明：产硫化氢菌株有的中心带黑色，但不如以上培养基明显。 亚丽桑那菌株乳糖阳性菌株粉色。

4、生化试验（第四天）

自选择性琼脂平板上分别挑取２个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36℃±1℃培养18h～24h，必要时可延长至48h。

接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时，可直接接种蛋白胨水（供做靛基质试验）、尿素琼脂（Ph7.2）、氰化钾（KCN）培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。于36℃±１℃培养18ｈ～24ｈ，必要时可延长至48ｈ。将已挑菌落的平板储存于２℃～５℃或室温至少保留２４ｈ，以备必要时复查。

三糖铁斜面培养结果：底层（+）、产硫化氢（黑色）、产气（有气泡）或不产气。

5、凝集试验（第五天）

 5.1  检查培养物有无自凝性         一般采用1.2％～1.5％琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。首先排除自凝集反应，在洁净的玻片上滴加一滴生理盐水，将待试培养物混合于生理盐水滴内，使成为均一性的混浊悬液，将玻片轻轻摇动30s～60s，在黑色背景下观察反应（必要时用放大镜观察），若出现可见的菌体凝集，即认为有自凝性，反之无自凝性。对无自凝的培养物参照下面方法进行血清学鉴定。

5.2  多价菌体抗原（O）鉴定         在玻片上划出２个约１cm×２cm的区域，挑取１环待测菌，各放1/2环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加１滴多价菌体（O）抗血清，在另一区域下部加入１滴生理盐水，作为对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌苔研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合１min，并对着黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。Ｏ 血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的（如２％～３％）培养基上再检查；如果是由于Ｖｉ抗原的存在而阻止了Ｏ凝集反应时，可挑取菌苔于１ｍＬ生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。

5.3 多价鞭毛抗原（H）鉴定         操作同5.2。Ｈ 抗原发育不良时，将菌株接种在0.55％～0.65％半固体琼脂平板的中央，待菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过接种装有0.3％～0.4％半固体琼脂的小玻管１次～２次，自远端取菌培养后再检查。

四、安全性评价（第五天）

1.典型沙门氏菌的平板分离现象：BS-菌落为黑色、有金属光泽；XLD-菌落为粉红色、带黑色中心。 2.生化实验现象：TSI——斜面产碱，底层产酸，产气，H2S+； 赖氨酸脱羧酶+；靛基质试验-；尿素琼脂-；KCN- 3.革兰氏染色：G-，红色短杆菌 4.血清学鉴定：血清凝集，+ 5.安全性评价：综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告25g(mL)样品中检出沙门氏菌。