肺炎克雷伯菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，ＫＰＮ）是临床常见革兰阴性致病菌，也是院内感染重要的病原菌。近年来该菌对多种药物的耐药性不断增强，并出现对第３代头孢菌素和碳青霉烯类耐药，增加了ＫＰＮ的治疗难度。产β－内酰胺酶（β－ｌａｃｔａｍａｓｅ）是革兰阴性杆菌对β－内酰胺类抗生素耐药的重要机制，而ＫＰＮ是常见的携带β－内酰胺酶基因的临床菌种，且具有β－内酰胺类和氨基糖苷类、喹诺酮类和磺胺类抗生素交叉耐药和多重耐药特质，使得临床上ＫＰＮ耐药普遍存在。

为了解长沙地区ＫＰＮ的β－内酰胺类耐药性和基因型的关系，本研究随机收集湘雅二医院分离的８２株ＫＰＮ，检测其对１８种常用β－内酰胺类抗生素的耐药情况，并采用ＰＣＲ扩增１６种β－内酰胺酶基因，分析ＫＰＮ耐药性与β－内酰胺酶基因型的相关性及其机制。

材料与方法

１材料

１．１菌株

中南大学湘雅二医院２０１６年８月至２０１７年２月从２０个临床科室的住院病人临床标本中分离的非重复ＫＰＮ８２株，均经ＰｈｏｅｎｉｘＴＭ１００全自动细菌鉴定系统鉴定并按第９版伯杰细菌鉴定手册要求确认为。

１．２主要试剂和仪器

ＭａｓｔｅｒＭｉｘＰＣＲ扩增试剂购自北京康为世纪生物科技有限公司；ＭａｒｋｅｒＩＤＮＡＬａｄｄｅｒ（１００－６００ｂｐ），１００ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒ（１００－１５００ｂｐ）及细菌基因组ＤＮＡ提取试剂盒（离心柱型）购自北京天根生化科技有限公司，ＢＩＯＷＥＳＴＲＥＧＵ－ＬＡＲＡＧＡＲＯＳＥＧ－１０琼脂糖购自上海玉博生物科技有限公司，ＧｏｌｄＶｉｅｗ核酸染色剂（ＥＢ替代品）购自北京赛百盛生物工程公司。ＰｈｏｅｎｉｘＴＭ１００全自动细菌鉴定系统购自美国ＢＤ公司；ＰＣＲ扩增仪购自美国应用生物系统公司；ＪＹ３００Ｃ型电泳仪购自北京君逸东方电泳设备有限公司；ＦｌｕｏｒＣｈｅｍＦＣ２凝胶成像系统购自美国ＡｌｐｈａＩｎｎｏｔｅｃｈ公司。

１．３β－内酰胺酶基因引物

β－内酰胺酶基因引物由北京天根生化科技有限公司合成。其中ＳＨＶ引物序列参考文献，ＣＴＸ－Ｍ－１，２，８引物序列参考文献，ＣＭＹ－４，８引物序列参考文献设计，其余均为自行设计。引物序列，退火温度及扩增片段大小见表１。