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关于L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶及其在催化合成稀有糖D-山梨糖中的应用

大C-会员头像-www.bzwz.com标准物质网 大C 0 450 2021-11-30
【摘要】本发明公开了L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶及其在催化合成稀有糖D-山梨糖中的应用,其基因序列为由SEQIDNO.1编码的野生型L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶分别经过其氨基酸第115、116、148、188或152位饱和定点突变。本发明通过对RhaD的氨基酸位点进行定点突变,克服了野生型RhaD催化合成D-山梨糖没有立体选择性的缺陷,实现了RhaD催化D-甘油醛为醛受体合成D-山梨糖时的立体选择性,使得催化反应产物以D-山梨糖为主,经过突变的RhaD的酶活高。本发明方法制备的定点突变的RhaD制备D-山梨糖,合成效率高、工艺简单、节约成本、D-山梨糖立体选择性催化效率最高达到91.7%。
  • 1 .定点突变的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶,其特征在于:所述定点突变的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶由基因序列为由SEQ ID NO .1编码的野生型L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶分别经过其氨基酸第115、116、148、188或152位饱和定点突变而产生的突变体。

    2.如权利要求1所述的定点突变的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶,其特征在于:所述其氨基酸第115、116、148、188或152位饱和定点突变而产生的突变体,包括L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶的突变体Y152W、突变体Y152Q、突变体Y152N、突变体P188Y、突变体T115A、突变体S116A、突变体I148A。

    3.如权利要求1或2所述的定点突变的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶,其特征在于:所述由SEQ ID NO .1编码的野生型L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶来源于大肠杆菌MG1655菌株。

    4.DNA分子,其特征在于:所述DNA分子编码权利要求2所述的定点突变的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶。

    5.质粒载体,其特征在于:所述质粒载体装载了权利要求4所述的DNA分子。

    6.如权利要求5所述的质粒载体,其特征在于:所述质粒载体为在pET-28a载体上装载了权利要求4所述的DNA分子。

    7 .权利要求1~3中任一所述的定点突变的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶在催化合成稀有糖D-山梨糖中的应用。

    8.权利要求1~3任一所述的定点突变的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶的制备方法,其特征在于:包括,构建突变株重组质粒:将野生型L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶基因片段连接到质粒载体上,得到野生型L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶基因重组质粒,以所述野生型L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶基因重组质粒为模版,对L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶基因编码氨基酸分别进行第115、116、148、188或152位氨基酸饱和定点突变,分别得到突变株重组质粒;突变株表达:将所述突变株重组质粒转化大肠杆菌,挑选单菌落接种,IPTG 16℃诱导表达定点突变的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶。

    9.如权利要求8所述的制备方法,其特征在于:还包括,蛋白纯化:将经过所述突变株表达的定点突变的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶进行纯化。

    10.如权利要求8或9所述的制备方法,其特征在于:所述质粒载体为pET-28a载体,所述突变株重组质粒包括pET28a-rhaDT115A、pET28a-rhaDS116A、pET28a-rhaDI148A、pET28arhaDP188Y、pET28a-rhaDY152W、pET28a-rhaDY152Q、pET28a-rhaDY152N,所述将突变株重组质粒转化大肠杆菌,为转化大肠杆菌BL21菌株。
     


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