羟脯氨酸（Hydroxyproline，Hyp）是胶原蛋白特有的氨基酸，因其在弹性蛋白中含量极少，且在其他蛋白中不存在，常作为胶原蛋白的特征标记物。动物水解蛋白是一种廉价蛋白原料，是以牛皮及其制品的下脚料等经粗加工后制成的水解蛋白，部分不良厂商在乳粉中掺入廉价的水解动物蛋白来替代乳蛋白，以提高乳中蛋白的质量分数，降低成本。由于水解过程中添加重铬酸钾和重铬酸钠等重金属盐，具有潜在的致癌和致畸作用，早在2009年就被列入我国“第二批食品中可能违法添加的非食用物质名单”。

羟脯氨酸作为这类蛋白特有的氨基酸，现已被作为非法添加动物水解蛋白的检测标记物。目前报道的羟脯氨酸的检测方法主要有：分光光度法、离子色谱法、液相色谱法、液相色谱-质谱法、自动氨基酸分析仪法等。作为禁用物质标记物的检测，结果的定性尤为重要，而上述方法在结果的准确确证方面还有不同程度的欠缺，即便使用液相色谱-串联四极杆质谱检测，由于奶粉中存在母离子和子离子均相近的亮氨酸和异亮氨酸，仍可能产生假阳性结果。

液相色谱-四极杆飞行时间质谱技术近年来日趋成熟，通过飞行时间质谱测定目标物和其碎片离子的精确质量数，对目标物进行定性，有助于排除假阳性结果，实现对禁用物质的确证分析。本文建立超高效液相色谱-四极杆/飞行时间质谱确证检测乳粉中羟脯氨酸的方法，对经氯胺-T分光光度法检测羟脯氨酸为阳性的乳粉样品进行了确证分析，结果表明方法准确可靠。

1材料与方法

1.1仪器与试剂

1.1.1仪器与条件

AcquityUPLC超高效液相色谱仪：美国Waters公司，由二元泵、柱温箱、自动进样器组成；AcquityU原PLCBEHHILIC色谱柱（2.1mm伊100mm，1.7滋m）：Waters公司；流动相A为乙腈，流动相B为10mmol/L乙酸铵水溶液，梯度洗脱程序为0~4min，由85%A线性变化至75%A；4min~6min线性变化至60%A，6min~8min线性变化至85%A，流速为0.4mL/min；柱温40益；进样量为10滋L。XEVOQTOF型四极杆飞行时间质谱仪：美国Wa原ters公司，配电喷雾电离源（ESI），带有Masslynx4.1和Targelynx软件。

操作参数为：电喷雾电离源正离子模式，毛细管电压3.5kV，锥孔电压18V，提取锥孔电压4V；源温135益，脱溶剂气温度450益，脱溶剂气流量800L/h，锥孔气流量50L/h。分别采用MSE和MS/MS两种扫描模式，MSE采集模式：低能通道碰撞能量为6eV，高能通道碰撞能量为10eV~30eV，质量扫描范围50amu~600amu；MS/MS采集模式：Q1设定为单位质量分辨，母离子质量数为132.06，碰撞能量为18eV，二级质谱扫描范围50amu~600amu。采用200pg/滋L亮氨酸-脑啡肽溶液进行实时质量校正（Lockmass），参比质量为556.2771amu。

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