0 引言

黄体酮是人体 内重要 的性激素之一 ，对维持女 性正常生理周期和生理 功能 、调节人机体代谢有重 要意义。女性 血清孕 酮水 平随生理周期 的不 同而 有 明显 的变 化 ，一般 为 l～60ng／mL ，男 性 一 般 在 0．1—0．2ng／mL之间。临床上测定血清孕酮主要用 于黄体功能 的判 断和异常妊娠的诊断。其测 定 的 常规方法主要为免疫分析法 J，但受校准和方法特 异性等原因 ，不 同方法 间结果 的变异往往 比较 大， 需要可靠的方法和标准物质实现其测定 的标 准化 。 为了满足临床实验室检测 的实际需要 ，本工作研制 了孕妇血清 中黄体酮成分分析标准物质 。 针对冰冻人血清 中黄体 酮成分分析标准 物质 的研究 ，目前 国内尚未有文献报道。本文利用 UPLC —ID — MS／MS -4]， 采用单 点法校正 ，根据 国 家一级标准物质技术规范 。 的要求 ，对冰冻 孕妇 血清中黄 体酮进行 了定值 、均匀 性 和稳 定性 的考 察 ，同时对定值结果进行 了不确定度评定 。

1 实验部分

1．1 仪 器和 试剂

超高效液相色谱 一质谱联用仪 ：TQS，美 国 waters公 司 ；天平 1：METI'LER TOLEDO UMX2(Max= 2．1g，d=0．1txg)，德 国梅特 勒公 司 ；天平 2：ME235S (Max：230g，d=0．01mg)，德国赛多利斯公 司；移液 器 ：200~L和 1000lxL，德 国；氮 气 吹干装 置 ：BF一 2000A，八方 世 纪公 司。 黄体酮纯度标准物质 8J：GBW(E)110119，纯度 99．20％，不 确定 度 为 0．5％ (中 国计 量科 学 研究 院)；黄体酮标记物 ：3，4一 C：，纯度 90％ (美 国剑 桥 同位素实验 室)；甲醇 、乙腈 和乙酸乙酯 ：高效液 相色谱 级 (德 国 Merck公 司 )；高纯 水 ，Millipore， 18Mf~·cm；甲酸 ：质谱级 (美国 Sigma公司)。

1．2 样 品采集

标准物质研 制所 需 的血清样 品 由安贞 医院和 军事医学科学 院提供 ，按 照 国家 标准 物质技 术规 范 一 的要求对备用原料进行过滤 、混匀 、分装 ，具 体制备工作 由军事 医学科学 院野 战输血研究所 承 担。最终原料孕妇血清采用 5mL冻存管包装 ，每支 血清量 2．5mL，在 一70℃下冰冻保存。

1．3 样 品 前处理

1．3．1 标准储备溶液与工作标准溶液的配制

配制采用重量法。将 一定量 的黄体 酮纯度标 准物质和同位素内标分别溶于一定量的甲醇 中，配 制成 浓度 为 lO00~xg／g的标 准储 备 液 (一20~C保 存)。配制工作标准溶液时用流动相逐级稀 释至与 血清中黄体酮的浓度接近，把两种溶液按 照浓度 比值为 1：l混合均匀 ，作为加标工作标 准溶液 ，血清 样品中也按照黄体酮与内标物 的浓度 比值 为 1：1 加入 内标溶液。

1．3．2 血清样品的预处理及其均匀性检验

血清属于复杂基 体 ，尤其是黄体 酮含量较低 ， 因此，需要萃取 、净化和浓缩等复杂的前处理技术 。 溶剂萃取和除蛋白质方法有多篇文献报道 ，本 实验采取了固相萃取(SPE)法从血清中富集黄体 酮。准确称取 500IxL血清于 lOmL离心管 中，等 比 例加入黄体酮标记溶液 ，分别称量其质量。

1)血清 样品用 6mI／)．5mol／L的磷 酸酸 化，在 室 温下平 衡 1h；

2)用 SPE柱分离 ，先用 5mL甲醇和 5mL水先后 活化 SPE柱 ，以 3～4mL／min的速度加样品溶液 ，再 用 12mL水和 5mL水／乙腈 (80：20体积 比)洗涤 ，最 后用 2mL甲醇洗脱 ；

3)洗脱液在 40~C下氮气吹干 ， 用 0．5mL水复溶后用 1mL乙酸乙酯再萃取两次 ，将 两次萃取液合并 ，在 40℃下氮气吹干；4)用流动相 复溶到原来浓度 ，充分 涡旋振荡 ，经 0．22 m 膜过 滤，供 UPLC—MS／MS测定。