Ⅳ_乙酰基神经氨酸(N—acetylneuraminicacid，NANA，结构式见图1)是唾液酸家族中最常见的一种。OHloHl3图1Ⅳ_乙酰基神经氨酸结构式唾液酸是一族神经氨酸的氮或氧基取代的衍生物，是一个含有9个碳原子并具有吡喃糖结构的酸性氨基糖，系统命名为5．氨基．3，5．二脱氧-D．甘油-D．半乳壬酮糖。5号碳上不同的连接基团构成了不同的唾液酸衍生物，最主要的两种唾液酸为5．乙酰氨基．3，5．二脱氧甘油_D。半乳壬酮糖(Ⅳ_乙酰神经氨酸)和3一脱氧-D．甘油Iz)一半乳壬酮糖(KDN)，其它唾液酸均由这两种衍生而成J。唾液酸广泛存在于动物组织和体液中L6J,是糖蛋白、低聚糖和糖脂的重要成分。ⅣI乙酰基神经氨酸能使唾液产生光滑的感觉，通过改变粘液的流体阻力充当免疫调节剂，以及在大脑和神经系统的产生和发育中发挥非常重要的作用。此外，Ⅳ．乙酰基神经氨酸是一种天然的营养成分，在燕窝圳、鹿茸n、鸡蛋n卜坨、奶粉等食品中含量较高，且已经作为一种营养辅助剂加人到婴幼儿配方奶粉中。经查新，国内外未发现Ⅳ-乙酰基神经氨酸标准物质，为了满足相关产品分析检测、质量控制工作的需求，保证检测结果的准确性、可比性和溯源性，结合标准物质的国际发展趋势，笔者制备了Ⅳ_乙酰基神经氨酸标准物质。

1实验部分

1．1主要仪器与试剂

半制备高效液相色谱系统：LC一6AD型，日本岛津公司；高效液相色谱仪：LC-20A型，日本岛津公司；旋转蒸发仪：EYELA．OSB_2100型，东京理化器械株式会社；冷冻干燥机：ALPHR1—2LDplus型，德国CHRIST公司；紫外可见分光光度计：UV-1800型，Et本岛津公司；傅立叶变换红外一近红外光谱仪：Spectrum400型，美国珀金一埃尔默公司；核磁共振谱仪：Bruker400MHz，德国Bruker公司；超高分辨飞行时间质谱仪：uHIOFmaXis4G型，德国Bruker公司；甲醇：色谱纯，美国ThermoFisher公司；超纯水：默克密理博Milli-QIntegral3纯水机生产。

1．2半制备色谱条件

色谱柱：SHIM-PACKPREP—ODS(H)·KIT柱(250mm×20mm，5m)；流动相：乙腈--0．1％磷酸(1：9)；流量：7mL／min；柱温：30℃；运行时间：11min；检测波长：203nrn。

1．3标准物质样品制备

取Ⅳ-乙酰基神经氨酸粗提品适量溶解于超纯水溶剂中，充分溶解后经半制备液相色谱系统分离纯化，收集目标峰馏分，进行旋蒸后冷冻干燥，最终获得纯度大于98％的高纯度化合物。经定性分析后，分装在干净、干燥的2mL棕色样品瓶中，于4~C冷藏。

1．4定性分析方法

经紫外光谱、红外光谱、质谱和核磁共振波谱分析，对Ⅳ．乙酰基神经氨酸进行定性。紫外光谱测定使用紫外一可见分光光度计，以乙腈为背景溶剂，于O一400nin下波长扫描，得到紫外光谱图。红外光谱测定使用傅立叶变换红外一近红外光谱仪，采用KBr压片法得到红外光谱图。质谱测定使用超高分辨飞行时间质谱仪，在正、负离子模式下测定，扫描范围(m／z)：100一l000。核磁共振波谱测定使用400MHz核磁共振谱仪，氘代试剂为DMSO一出(含TMS)，25℃条件下得到氢谱和碳谱。

1．5纯度定值分析方法

采用高效液相色谱技术测定标准物质纯度，并通过8家实验室协作对本标准物质进行定值。从不同HPLC洗脱条件、不同色谱柱等多方面对所制备样品的纯度进行定值。

1．5．1不同色谱柱条件

采用两根C8色谱柱WatersXTerraRPC18柱(150InlTl×4．6mm，5m)和WatersAtlantisHILICSilica柱(150mm×4．6mm，5rn)，在相同的流动相、不同流动相配比的条件下测定Ⅳ-乙酰基神经氨酸标准物质纯度。(1)WatersXTerraRPC18柱的色谱条件流动相：乙腈一O．1％磷酸(1：9，流量为1．0mL／min；柱温：30℃；运行时间：20min；检测波长：203nlTl。(2)WatersAtlantisHILICSilica柱的色谱条件流动相：乙腈-0．1％磷酸(95：5)，流量为1．0mL／min；柱温：25oC；运行时间：20min；检测波长：203nm。

1．5．2不同流动相条件

流动相：甲醇一0．1％磷酸(8：2)与乙腈-0．1％磷酸(95：5)，流量均为1．0mL／min；柱温：30℃；运行时间：20min；检测波长：203nnl。

1．5．3定值色谱条件

色谱柱：WatersAtlantisHILICSilica柱(150nqlTl×4．6m／n，5m)；流动相：乙腈-0．1％磷酸(95：5)，流量为lmL／min；柱温：25℃；运行时间：20min；检测波长：203nm。此方法为最终定值确定方法，为了保证定值结果的准确度，8家定值单位均采用此方法进行定值。