第三阶段为类胡萝卜素类物质的合成。DAMPP和IPP以1:3的比例在焦磷酸合成酶的作用下合成法尼基二磷酸，FPP在焦磷酸合成酶的作用下生成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸。GGPP在八氢番茄红素合成酶和植物烯去饱和酶作用下缩合形成番茄红素，番茄红素在番茄红素环化酶作用下合成β-胡萝卜素。第三阶段虾青素的合成在不同生物体内合成路径有所不同，但主要都是通过β-胡萝卜素羟基化和酮基化合成。在红法夫酵母中，虾青素由玉米黄质在细胞色素P450酶作用下催化合成；在细菌和藻类中，主要通过β-胡萝卜素羟化酶和β-胡萝卜素酮醇酶催化合成。玉米黄质是由β-隐黄质经专一性酶β-胡萝卜素羟化酶作用转化而成，β-胡萝卜素中的烯酮和4-酮体玉米黄质在β-胡萝卜素酮醇酶作用下合成角黄素，角黄素经由磷黄嘌呤（角磷酰胺）形成虾青素。在不同物种中，β-胡萝卜素羟化酶和β-胡萝卜素酮醇酶将β-胡萝卜素催化生成虾青素的过程中作用的先后顺序不一样。Liu等在集胞藻中使用异源表达的雨生红球藻的β-胡萝卜素酮醇酶发现，集胞藻细胞中首次合成虾青素，且含量达到（4.81±0.06）mg/g细胞干重。体外试验也进一步证实，在雨生红球藻中虾青素合成的最佳路径是酮醇酶的催化反应在前，其次是羟化酶的羟基化反应。

一些细菌中虾青素合成代谢的前体物质的存在，以及虾青素合成途径中多种关键基因的确定，为构建虾青素高产工程菌株提供了可能。研究发现，通过将海洋细菌海云衫副球菌来源的类胡萝卜素基因crtW,crtZ,crtY,crtI,crtB和crtE转入E.coli，成功地构建出产虾青素的大肠杆菌工程菌株，且产量高达400μg/gDCW。在E.coli中，两种主要限速酶DXP合酶和IPP异构酶过表达增加IPP和DMAPP的供应。通过增加异戊二烯前体的代谢通量，可以使番茄红素或β-胡萝卜素等类胡萝卜素的产量显著增加。然而，对于大肠杆菌中虾青素的异源生物合成而言，将β-胡萝卜素转化为虾青素是实现虾青素高效生物合成的最关键步骤。利用λRed重组技术构建出不含质粒的E.coli，将菠萝泛菌和念珠藻的叶黄素生物合成基因整合到E.coliBW-CARO的染色体上得到工程菌株E.coliBW-ASTA，该菌株异源表达后得到虾青素产量为1.4mg/gDCW。在谷氨酸棒杆菌中表达Fulvimarinapelagi来源番茄红素环化酶CrtY，β-胡萝卜素酮醇酶CrtW和β-胡萝卜素羟化酶CrtZ的编码基因后，C.glutamicum成功合成虾青素，产量可以达到0.4mg/L/h。虽然细菌自身合成虾青素的水平与藻类差距较大，但细菌中虾青素的合成具有重要意义，为后续工程菌株的构建提供了相应的基因序列。

相关链接：焦磷酸，谷氨酸，β-胡萝卜素