五、色谱理论基础

色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离，组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远。两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关。但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。因此，要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。
一、塔板理论
（一）分配系数K和分配比k
1．分配系数K
分配色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相之间反复多次的分配过程，而吸附色谐的分离是基于反复多次的吸附脱附过程。这种分离过程经常用样品分子在两相间的分配来描述，而描述这种分配的参数称为分配系数K。
它是指在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值，
K＝溶质在固定相中的浓度／溶质在流动相中的浓度＝Cs／Cm
分配系数是由组分和固定相的热力学性质决定的，它是每一个溶质的特征值，它仅与两个变量有关：固定相和温度。与两相体积、柱管的特性以及所使用的仪器无关。
2分配比k
分配比又称容量因子，它是指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比。即：

k＝组分在固定相中的质量/组分在流动相中的质量＝ms／mm k值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大，因此又称分配容量或容量因子。它是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数。k值也决定于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱温、柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关。
k=ms/mm=CsVs/CmVm
式中Cs，Cm分别为组分在固定相和流动相的浓度；Vm为柱中流动相的体积，近似等于死体积。Vs为柱中固定相的体积，在各种不同类型的色谱中有不同的含义。
例如：在分配色谱中，Vs表示固定液的体积；在尺寸排阻色谱中，则表示固定相的孔体积。
分配比k值可直接从色谱图中测得
k=(tr-t0)/r/t0=Vr/V0
分配系数K与分配比k的关系
K=kβ
其中β称为相比率，它是反映各种色谱柱柱型特点的又一个参数。例如：对填充柱，其β值一般为635：对毛细管柱，其β值为60600。
4．分配系数K及分配比k与选择因子a的关系
对A、B两组分的选择因子，用下式表示：
a=tR(B)/tr(A)=k(A)/k(B)=K(A)/K(B)
通过选择因子a把实验测量值k与热力学性质的分配系数K直接联系起来，a对固定相的选择具有实际意义。如果两组分的K或k值相等，则a＝1，两个组分的色谱峰必将重合，说明分不开。两组分的K或k值相差越大，则分离得越好。因此两组分具有不同的分配系数是色谱分离的先决条件。
5．色谱基本保留方程
Vr=Vg+KV1
作为一个色谱理论，它不仅应说明组分在色谱柱中移动的速率，而且应说明组分在移动过程中引起区域扩宽的各种因素。塔板理论和速率理论均以色谱过程中分配系数恒定为前提，故称为线性色谱理论
（二）塔板理论
把色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，同时引入理论塔板数作为衡量柱效率的指标，即色谱柱是由一系列连续的、相等水平的塔板组成。每一块塔板的高度用H表示，称为塔板高度，简称板高。
塔板理论假设
1．在柱内一小段长度H内，组分可以在两相间迅速达到平衡。这一小段柱长称为理论塔板高度H。
2．以气相色谱为例，載气进入色谱柱不是连续进行的，而是脉动式，每次进气为一个塔板体积（△Vm）。
3．所有组分开始时存在于第0号塔板上，而且试样沿轴（纵）向扩散可忽略。
4．分配系数在所有塔板上是常数，与组分在某一塔板上的量无关。
简单地认为：在每一块塔板上，溶质在两相间很快达到分配平衡，然后随着流动相按一个一个塔板的方式向前移动。对于一根长为L的色谱柱，溶质平衡的次数应为：n=L/H
n称为理论塔板数。与精馏塔一样，色谱柱的柱效随理论塔板数n的增加而增加，随板高H的增大而减小。
塔板理论指出：
第一，当溶质在柱中的平衡次数，即理论塔板数n大于50时，可得到基本对称的峰形曲线。在色谱柱中，n值一般很大，如气相色谱柱的n约为103106，因而这时的流出曲线可趋近于正态分布曲线。
第二，当样品进入色谱柱后，只要各组分在两相间的分配系数有微小差异，经过反复多次的分配平衡后，仍可获得良好的分离。
第三，n与半峰宽及峰底宽的关系式为
n=5.54(tr/W1/2)² =16(tr/W)²

式中tr与W1/2（W应采用同一单位（时间或距离）
从公式可以看出，在tr一定时，如果色谱峰很窄，则说明n越大，H越小,柱效能越高。在实际工作中，由公式
n＝L／H和n=5.54(tr/W1/2)² =16(tr/W)²

计算出来的的n和H值有时并不能充分地反映色谱柱的分离效能，因为采用tR计算时没有扣除死时间tM，所以常用有效塔板数n有效表示柱效:
n有效＝5.54(tr/W1/2)² =16(tr/W)²

有效板高:
H有效＝L／有效
因为在相同的色谱条件下，对不同的物质计算的塔板数不一样，因此，在说明柱效时除注明色谱条件外，还应指出用什么物质进行测量。
例：已知某组分峰的峰底宽为40s，保留时间为400，计算此色谱柱的理论塔板数。
解：n＝16（tR／W）2＝16(400／40）2＝1600块
塔板理论是一种半经验性理论。它用热力学的观点定量说明了溶质在色谱柱中移动的速率，解释了流出曲线的形状，并提出了计算和评价柱效高低的参数。但是，色谱过程不仅受热力学因素的影响，而且还与分子的扩散、传质等动力学因素有关，因此塔板理论只能定性地给出板高的概念，却不能解释板高受哪些因素影响，也不能说明为什么在不同的流速下，以测得不同的理论塔板数，因而限制了它的应用。