盐藻在我国保健食品中研究进展（二）

（2）几何异构体的鉴定

在理论上，β-胡萝卜素几何异构体的鉴定也可以在其双向核磁共振谱(NMR)上实现。但目前没有文献报道。

β-胡萝卜素异构体的电子吸收光谱特不同。顺式异构体的主吸收峰与反式异构体的主吸收峰相比，其电子吸收光谱发生“紫移”。同时，顺式异构体在342～348nm处会出现一个特征吸收峰。这些光谱特征可作为判断β-胡萝卜素异构体的重要依据。

如上所述，由于分子在一个双键处发生了顺式异构，在β-胡萝卜素的电子吸收光谱上342～348nm处会出现一个峰(吸收段)。这个峰被称为“顺式峰”(cis-peak)。分子中发生顺式异构的部分被称为“cis-band”。同时，与全反式异构体比较，顺式异构体主吸收峰的最大吸收波长(λmax)也会发生轻度的“紫移”。图3中的I、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ号峰的电子吸收光谱图在λmax=342～347nm左右与全反式异构体的光谱比较可以看到有明显的峰存在，详见图2；图3为顺式峰的相对高度；同时，与Ⅳ号峰的光谱比较，I、Ⅱ、Ⅲ号峰光谱主吸收峰和顺式吸收峰的λmax；分别发生了5～6nm和1～4nm的“紫移”，见图4。这些光谱特征的变化提供了将I、Ⅱ、Ⅲ号峰鉴定为β-胡萝l、素顺式异构体的证据。

（3）几何异构体的定量测定

在C30-HPLC上，β-胡萝卜素的几何异构体可以获得良好的分离。由于参比样品的匮乏，β-胡萝卜素顺式异构体的定量需基于其电子吸收光谱范围内的吸光系数。蒸发光散射检测器(ELSD)的使用可以实现这个目的。在ELSD上收集β-胡萝卜素全反式异构体信号的条件已由惠伯棣等人建立完成。使用LC-PDA-ELSD串联系统，同步收集每个β-胡萝卜素几何异构体组分的电子吸收光谱和质量信号，由二者峰面积之比推算每个组分的吸光系数，最终实现在C30-HPLC-PDA系统上β-胡萝卜素各几何异构体的定量检测。最终根据其色谱峰面积，可以准确测量出β-胡萝卜素几何异构体的组成。

一般情况下，用于定量分析的吸光系数是指在该化合物在λmax处的吸光系数。β-胡萝卜素全反式异构体于450nm处的吸光系数已被报道，如A^1%_1cm。一般在2500左右。

毫无疑问，在PDA检测器上，一种β-胡萝卜素顺式异构体的量与其在检测波长处的色谱峰面积呈正线性相关关系，符合朗伯-比尔定律。如果在ELSD检测器上，这种顺式异构体的量与其峰面积间亦存在正线性相关关系，则可回归其在PDA和ELSD上峰面积之间的线性相关关系，并计算其斜率。最终，按下列方法估算这种顺式异构体的吸光系数。

A_Z=A_E（K_Z/K_E)

其中：

A_Z=顺式异构体吸光系数；

A_E=全反式异构体吸光系数；

K_Z=顺式异构体斜率=PDA峰面积／ELSD峰面积；

K_E=全反式异构体斜率=PDA峰面积／ELSD峰面积；

根据朗伯-比尔定律，按下列公式计算β-胡萝卜素异构体的含量。

x=(A×y)／(A^1％_1cm×100000)

其中：

X=样品中所含的b，β-胡萝卜素异构体的量(克)；

Y=样品溶液的体积(毫升)；

A=样品中各组分的峰面积(毫伏·秒)，A^1％_1cm=吸光系数，为在1厘米光程长的比色杯中1％(w／v)浓度溶质的理论吸收值，计算β-胡萝卜素全反式异构体含量时采用值为ε=2500(450nm)。

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